临床微生物学是一门实践性很强的学科,近年来发展迅速,出现了许多新的检验方法和技术,如自动、半自动微生物鉴定系统等,尽管如此,实验室仍然离不开传统的鉴定和分类方法,形态学是细菌和真菌检查的主要内容之一。
微生物形态学包括培养皿标本和显微镜下结构,培养皿标本主要观察菌落的大小、外观、边缘形态、颜色、光泽、溶血情况等特征;显微镜下主要观察微生物个体的大小、形状、排列、染色性、菌丝和孢子的数目及形态,有无芽胞、荚膜和鞭毛等特殊结构,结合生化特性,以此对微生物进行鉴定分类。
在医学摄影中,微生物是我们经常拍摄的对象。微生物的拍摄不同于平常的临床病例、标本及实验过程(如动物实验)的拍摄,微生物是培养于密闭透明容器中的生物体,拍摄中往往难以解决容器的反光、细微结构的表现及把握色彩还原标准等问题,拍摄器材、拍摄环境、光源的应用及拍摄方法等等,都是拍摄成败至关重要的诸多方面。
1 摄影器材
为了确保被摄体不变形,图片清晰度高并能反映微生物的细微结构,首先要准备微距摄影器材,如近摄接圈、增距镜或微距镜等,它们不仅成像质量好,而且在控制透视变形、色彩还原和清晰度方面都有较好的表现,其次要确保拍摄时无震动,拟选用稳定性好、角度调节灵活的三角架,快门线要长一些,这些对于提高清晰度非常重要,除此之外,还要备一块边长30~40公分大小的反光板,对调整光比、提高图片质感等很有帮助。微观形态需要解像度较好的显微镜摄影器材。
2 拍摄方法
目前常用的培养器具多为玻璃质的培养平板及试管,其特点是透明度好,便于观察微生物生长变化情况。由于玻璃的反光性强,是拍摄中较难解决的问题,特别是试管的拍摄,布光难度更大;另外,玻璃器的透明性对于微生物的色彩还原、形态表现也常常会带来一些问题。因此,培养器具的拍摄应把握好背景的选择、合理的布光及色彩还原。
2.1背景选择 背景对主体的影响往往是鲜明的,平时我们拍摄标本或其它物体时,一般选择色彩差别较大的背景。拍黑白片时,用具有一定亮度差别的背景,使主体与背景有明显的区别。由于培养器具是透明或半透明的,而菌落也会呈现出不同的透明度,背景对菌落色彩还原影响较大,因此,在背景选择上一般多避开艳丽的颜色,大多选择黑、白或灰色背景。图1~图3为聚多曲霉培养平板,在三个不同背景下拍摄的情况。
结果,在黑背景下菌体得到了正确的还原,菌落边缘为淡灰色,表现很好;在蓝背景下,菌落边缘变成黄色,菌体偏红黄;在白色背景上,边缘色难以表现出来,菌落色彩暗淡。因此,背景选择非常重要,特别是菌落边缘色受背景的影响更大,菌落边缘色淡,选择深背景,反之则选择淡背景。图4、图5 为红色毛癣菌培养平板,菌落边缘为淡黄色,有丝状物向外延伸生长,在黑背景上得到很好的表现,在白背景上,菌落中间部分没有明显变化,但菌落边缘色及丝状结构却没有表现出来。
图1 图2 图3
2.2合理用光 如何表现微生物在培养器中的形态特征,合理用光很关键。光源方向与被摄体、照相机三者之间的位置、角度关系、光比的控制等都对微生物的真实记录有着特殊的作用。
直射光可使被摄体均匀受光,物体光比小,但照片缺乏层次感;侧光可使被摄体产生一定的光比,层次丰富,立体效果好,但光比过大会损失细微结构。因此,培养皿拍摄用光要把握不同方位光源的相互协调。有些菌落,凹凸很明显,容易产生光线的明暗对比,有质感,
图4 图5
拍摄时光比要控制小一些,能使细微层次不被丢失。而表面较平滑的菌落拍摄时要靠调整光源角度,增加光比,使其产生明暗差,才能将形态特征表现出来。 图6为猪小孢子菌,拍摄时光源与平板呈20度角,菌落层次得到很好的表现。
有的菌落本身明暗对比强烈,如带有孢子的菌类,往往菌落上有像棉花样的白色菌团,控制不好,不是高密度部分漆黑一团,就是低密度部分亮光一片,甚至两者均有层次细节丢失,拍摄时需要对光源进行柔化处理,使其明暗对比得到控制。直射光硬度强,可在灯具前加柔光纱、柔光纸等降低光源的硬度,也可以用反射光、散射光或室内自然光与反光板协调布光,这些方法都可以软化光质,有效的控制菌落明暗对比,使照片层次丰富。
图6 图7 图8
BR> 调整相机与光源的角度可以避开反光的干扰。当照相机与光源处于同一方位时,反光容易进入视角;相机与光源角度越大,反光偏离视点越远。有时还可以用遮光方法消除反光点,方法是用小纸板遮住光源的某个部位,上下或左右移动,在相机里观察,直到既没有反光又能表现菌落形态时再拍摄。试管是圆柱形培养器,消除反光很困难,用遮光办法可以得到满意的拍摄效果。图7是李斯特菌在半固体培养基试管中的生长情况,细菌自穿刺线向四周曼延生长,在半透明液体中呈伞状,菌落清晰可见,试管无明显反光点干扰。布光方法:主光与试管成轴向,偏离试管约15度,轮廓光位于试管背侧,用遮光板消除反光。
2.3拍摄角度 照相机与培养皿成垂直角拍摄,能够准确的表达菌落的形状及相互排列关系。有的菌落很特殊,形态特征需要在光源与视角处于某一特定的位置关系时才能表现出来,图8为艾肯菌,在光源与平板30度角、照相机与平板40度角、相机与光源位置相对时拍摄的,显现出环状菌落,中间有点状凸起的形态特征。
2.4色彩还原 平时印放照片总能找到照片中熟知的颜色作为矫正依据,如人的肤色,花草树木等自然景色。而细菌千万种,每种细菌都有其各自不同的颜色特征,颜色也是鉴别细菌的主要依据,必须还原准确。还原图片颜色要把握以下三点:(1)拍摄前要调整好光源色温,使其接近胶卷要求的色温值,并避免周围其它光线的干扰。(2)防止拍摄环境色调的影响,如室内墙壁色或周围较大物体的色块都对色彩还原有一定的影响。(3)选定光源和拍摄场地后,首先拍一张含有多种色彩的色板作为放大照片时的标准色,培养皿的拍摄应与色板拍摄条件完全相同,并把握适度的?ス饬俊7糯笳掌?时,矫正了色板颜色,菌落颜色就不会有很大的误差,最后再由实验人员把关。
3 显微摄影
近年来,显微摄影器材发展迅速,先进的显微照相机不仅成像质量好,而且还具备一些如色温调整、?ス饪刂萍胺蓝抖?等功能,给显微摄影带来很大方便。但拍好显微照片还要注意以下问题:(1)涂片制作好以后应尽早拍摄,以保证照片色彩鲜艳、最佳表现细菌形态。有时,实验室提供标本涂片保存太久,褪色严重,又无法重新制作,此时可再一次对涂片染色,能提高细菌显现度。拍摄时还可以用滤色片来提高对比度,增强细微结构表现力,但会加大照片偏色程度,要根据拍摄意图而定。(2)对不同反差的标本涂片,应控制不同的底片密度,显微摄影采用自动?ス猓?一般都能获得满意的照片质量,但对于反差过大或过低的标本涂片来讲,完全按照测光值进行?ス饩筒惶?适合。标本涂片反差小,宜取底片密度高一些,可增强照片反差,反之应减少?ス饬俊6怨庠唇?行柔化处理,如光澜前加柔光镜、柔光纸等,也可以起到降低反差效果。(3)光源强度对微生物的表现也有很大的影响。由于显微镜是用透视光观察,光线太强会使细微结构折射消失,往往难以拍出如菌丝、芽胞、鞭毛等细微结构,降低光源强度,适当增加?ス猓?能使细微结构更好的得以表现。
拍好微生物照片除掌握基本的拍摄方法外,还要与实验员密切合作,相互沟通,了解一些微生物相关知识,熟悉其形态特点,有助于更好的完成拍摄